不同工艺提取的竹节参皂苷粗提物毒性及其抗炎作用初步研究

   阅文网   2020-07-27 00:00:00

  摘要:目的 比较不同工艺提取的竹节参皂苷粗提物的毒性及抗炎效果。方法 采用不同工艺分别制备竹节参皂苷粗提物样品1、样品2、样品3、样品4、样品5、样品6,然后用不同工艺、不同浓度的样品处理raw264.7细胞,显微镜下观察细胞形态,噻唑蓝(mtt)法检测细胞活力,一氧化氮(no)试剂盒检测raw264.7细胞no释放量。结果 不同样品作用于raw264.7细胞毒性从小到大依次为:样品4<样品6<样品5<样品2<样品1<样品3。不同样品对脂多糖刺激的raw264.7细胞no释放抑制效果依次为:样品4>样品5>样品2>样品6>样品1>样品3。结论 6种不同提取工艺得到的竹节参皂苷粗提物中,泡沫分离法提取的竹节参皂苷粗提物毒性最小,抗炎效果最好。
  关键词:皂苷;提取工艺;竹节参皂苷粗提物;抗炎;细胞活力
  竹节参及其活性成分竹节参总皂苷具有抗炎、镇痛、免疫调节、抗氧化活性等多种药理活性,且不同提取方法对竹节参皂苷生物活性的影响很大[1-5]。本研究采用不同工艺提取竹节参中的皂苷成分,并建立脂多糖(lps)致raw264.7细胞炎症模型,对竹节参不同工艺提取的皂苷粗提物的毒性及抗炎活性进行了初步研究,以期为竹节参提取工艺及深入研究提供实验依据。
  1 实验材料
  1.1 药物、细胞与试剂
  竹节参采于湖北恩施椿木营竹节参种植基地,经三峡大学湖北省天然产物研究与利用重点实验室邹坤教授鉴定为五加科人参属植物panax japonicus c.a.mey。小鼠单核巨噬白血病细胞株raw264.7购于中国科学院上海细胞库。dmem高糖培养基,gbico公司,批号884684;胎牛血清,杭州四季清公司,批号100607;lps(b5:o55),sigma公司,批号110m4086v;一氧化氮(no)检测试剂盒,上海碧云天生物技术有限公司,批号s0021-3。
  1.2 仪器
  nu-4750e 型二氧化碳培养箱(nu aire公司);sw-4t-2f洁净工作台(上海博讯实业有限公司医疗设备厂),ckx41倒置显微镜(日本奥林巴斯公司),td25-ws多管架自动平衡离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司),thermo全波长酶标仪(芬兰,tecan inpinifetmf 200)。
  2 实验方法
  2.1 样品制备
  2.1.1 乙醇加热回流提取法 参照文献[6]方法。竹节参药材100 g,10倍量60%乙醇加热回流提取3次,2 h 1次,合并提取液并减压回收溶剂至无醇味,80 ℃水浴,浓缩至原药材质量5倍,滤除不溶亲脂性杂质,上清液用水饱和正丁醇等量萃取3次,回收正丁醇,然后加入适量85%乙醇溶液溶解竹节参总皂苷粗提物,并不断搅拌缓慢加入丙酮,常温静置,待沉淀完全析出,3500~4000 r/min离心15 min,收集沉淀物,并用适量丙酮洗涤,减压真空干燥,得提取物粉末样品1。
  2.1.2 乙醇超声提取法 竹节参药材100 g,置锥形瓶中,加入60%乙醇500 ml,超声处理(功率250 w,频率50 khz)40 min,摇匀,滤过,重复提取3次,合并滤液,回收溶剂,减压真空干燥,得提取物粉末样品2。
  2.1.3 水饱和正丁醇超声提取法 竹节参药材100 g,置锥形瓶中,加入水饱和正丁醇500 ml,超声处理(功率250 w,频率50 khz)40 min,摇匀滤过,重复提取3次,合并滤液,回收溶剂,然后加入适量85%乙醇溶解竹节参总皂苷粗提物,并不断搅拌缓慢加入丙酮,常温静置,待沉淀完全析出,收集沉淀物,并用适量丙酮洗涤,减压真空干燥,得提取物粉末样品3。
  2.1.4 泡沫分离提取法 竹节参药材100 g,10倍量纯水加热回流提取3次,提取液浓缩至500 ml,调ph值至4.88,加入到泡沫分离装置中,控制气体流速为400 ml/min,进行分离,收集泡沫,乙醇消泡,分离结束后挥干溶剂,减压真空干燥,得提取物粉末样品4。
  2.1.5 水提醇沉提取法 竹节参药材100 g,10倍量双蒸水提取3次,2 h 1次,合并滤液浓缩至原药材质量的5倍,加60%乙醇静置过夜,悬浊液于3500 r/min离心15 min,上清液水饱和正丁醇等量萃取3次,回收正丁醇,然后加入适量85%乙醇溶液溶解竹节参总皂苷粗提物,并不断搅拌缓慢加入丙酮,常温静置,待沉淀完全析出,收集沉淀物,并用适量丙酮洗涤,减压真空干燥,得提取物粉末样品5。
  2.1.6 大孔吸附树脂提取法 竹节参药材100 g,10倍量双蒸水提取3次,2 h 1次,合并滤液后浓缩至原药材质量的5倍,加95%乙醇至乙醇终浓度为60%,静置过夜,悬浊液于3500 r/min离心15 min,上清液水饱和正丁醇等量萃取3次,回收正丁醇。然后用60%乙醇洗脱竹节参总皂苷粗提物,过大孔吸附树脂纯化, 不断搅拌洗脱液并缓慢加入丙酮,常温静置,待沉淀析出完全,收集沉淀物,并用适量丙酮洗,减压真空干燥,得提取物粉末样品6。
  2.2 细胞培养
  raw264.7细胞株的复苏:用75%酒精擦拭超净工作台,紫外线照射超净工作台30 min,从液氮罐中取出冻存管,迅速将冻存管放到已经预热的水浴锅(37 ℃)中迅速解冻,不断摇动,待冻存管内液体完全溶解(控制在1 min内),取出用酒精棉球擦拭冻存管外壁,再拿入超净台内,将冻存管内的液体转入15 ml离心管,加入2倍体积含10%胎牛血清的dmem培养基,800 r/min离心5 min,弃去上清液,重悬细胞,接种到培养瓶中,37 ℃、5% co2条件下培养。传代:待细胞长至90%后,从培养箱内取出细胞,小心吸出旧培养液,用pbs清洗,加入3 ml 10%胎牛血清的dmem培养基,用细胞刮棒沿一个方向轻轻将细胞刮下来,将细胞悬液转移到15 ml离心管中,800 r/min离心5 min,弃去上清液,加入培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液,分装入培养瓶后,放入培养箱37 ℃、5%co2条件下培养。冻存:当细胞长至80%~90%时,将细胞收集起来,将胎牛血清与二甲基亚砜(dmso)按照9∶1的比列配制好冻存液。然后每管中加入2 ml冻存液转移至冻存管中,依次放在4 ℃中40 min、-20 ℃中40 min、-80 ℃过夜,第2日转移至液氮灌中保存。   2.3 raw264.7细胞活力测定
  将raw264.7接种于96孔板,细胞数为105个/ml,每孔100 μl,贴壁后,设置调零孔(只有培养液)、正常组、给药组,给药浓度为5、10、20、40、80 μg/ml,每组4个复孔,24 h后吸取上清液,在每孔中加入含mtt的培养液,继续培养4 h,然后将上清去掉,每孔加入150 μl dmso,置摇床上低速震荡10 min,使结晶充分溶解,在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔吸光度。
  2.4 raw264.7细胞一氧化氮释放量测定
  将raw264.7接种96孔板,细胞数为105个/ml,每孔100 μl,贴壁后,同时加入不同提取工艺的竹节参皂苷(浓度为10、1 μg/ml)和1 μg/ml lps作用,设为空白组、lps组、lps+竹节参皂苷组,每组4个复孔,24 h后,取上清液50 μl,依次加入griessⅰ和griessⅱ各50 μl,37 ℃恒温箱中反应30 min,在酶联免疫检测仪540 nm处测量各孔吸光度。
  3 统计学方法
  采用spss13.0统计软件进行分析。所有数据均以—x±s表示,采用方差分析进行多组间差异比较,以dunnett-t检验比较两组间均数的差异。p<0.05表示差异有统计学意义。
  4 结果
  4.1 不同提取工艺竹节参皂苷粗提物对raw264.7细胞活力的影响
  形态学观察正常组的细胞呈圆形;与正常组比较,样品1和样品2的药物浓度在40 μg/ml以下时对细胞形体无显著影响;浓度达到40 μg/ml时细胞明显肿胀变大,细胞膜逐渐模糊,细胞数量减少,细胞活力分别为63.24%和76.65%(p<0.01);浓度为80 μg/ml时细胞膜已经破碎溶解,细胞基本死亡,细胞活力分别为3.28%和4.10%(p<0.01)。样品3药物浓度为40 μg/ml和80 μg/ml时,细胞已经基本死亡,细胞活力分别为1.98%和1.03%(p<0.01)。样品4药物浓度对细胞形态均无明显影响,当药物浓度为80 μg/ml时,其活力值达到90.63%。样品5和样品6浓度在≤40 μg/ml时,对细胞无明显影响;当浓度达到80 μg/ml时,细胞出现死亡,细胞活力分别降至2.94%和9.30%(p<0.01)。结果见表1。因此样品的安全范围为<40 μg/ml。
  4.2 不同提取工艺竹节参皂苷粗提物对脂多糖刺激细胞一氧化氮释放的影响
  通过细胞形态观察及mtt活力检测,发现当lps与样品共同作用时,会加重细胞损伤。当样品1浓度为10 μg/ml、样品3浓度为1 μg/ml和10 μg/ml时,细胞活力分别降至53.74%、79.15%和25.99%(p<0.01),提示这几组将不参与no释放比较。而其他样品在浓度为1 μg/ml和10 μg/ml时与lps共同作用细胞时,则对细胞活力无明显影响,见表2。
  采用griess法检测细胞no释放水平,与正常组比较,lps组显著升高no释放量,释放量是正常组的4倍(p<0.01);加入1 μg/ml样品处理后,样品1、2、4、5、6对lps刺激细胞释放no的抑制率分别为25.61%、34.32%、42.80%、26.42%、32.06%;加入10 μg/ml样品处理后,样品2、4、5、6对lps刺激细胞释放no的抑制率分别为51.09%、55.75%、59.65%、46.34%,差异有统计学意义(p<0.01)。结果见表3。
  5 讨论
  no是存在于哺乳动物中常见的信号分子,由l-精氨酸、氧分子、还原型辅酶ⅱ及其他辅助因子在不同类型一氧化氮合酶(nos)催化下合成。no可以产生于人体内多种细胞,在心血管、免疫、神经等系统中均扮演着重要的角色。在炎症反应中,no是判断炎症最基本的指标,主要由诱导型一氧化氮合酶(inos)催化合成,信号通路主要包括p38 mapk、erk1/2或者nf-κb,研究发现抑制p38 mapk、erk1/2或者nf-κb能够阻碍inos蛋白合成,导致no减少,继而发挥抗炎保护效应[6]。lps是no合成的强诱导剂,通过对巨噬细胞内inos基因的诱导,而导致no的大量合成和分泌。
  本实验结果表明,采用不同工艺提取的竹节参皂苷粗提物对细胞活力影响不同,作用于raw264.7细胞株的毒性依次为:样品4<样品6<样品5<样品2<样品1<样品3;对应的提取工艺分别是泡沫分离提取法、大孔吸附树脂提取法、水提醇沉提取法、乙醇超声提取法、乙醇加热回流提取法以及水饱和正丁醇超声提取法,这表明采用泡沫分离工艺提取的总皂苷对细胞毒性最小。研究还发现,不同提取工艺竹节参皂苷粗提物干预lps刺激的raw264.7巨噬细胞后,可剂量依赖性抑制其no产生,巨噬细胞的形态也趋于正常,样品抑制效果依次为:样品4>样品5>样品2>样品6>样品1>样品3,分别对应的提取工艺为泡沫分离提取法、水提醇沉提取法、乙醇超声提取法、大孔吸附树脂提取法、乙醇加热回流提取法和水饱和正丁醇超声提取法。提示在这6种不同提取工艺得到的竹节参皂苷粗提物中,运用泡沫分离法提取的竹节参皂苷粗提物不仅毒性小,而且其抗炎效果最好。
  参考文献:
  [1] 敖明章.竹节参皂苷抗炎抗风湿作用及机理研究[d].武汉:华中科技大学,2012.
  [2] 文德鉴,张翠兰,陈国栋,等.竹节参总皂苷镇痛作用的实验研究[j].时珍国医国药,2008,19(8):1983-1984.
  [3] 张长城,蒋美杰,赵海霞,等.竹节参总皂苷对环磷酰胺致免疫低下小鼠免疫功能的影响[j].中成药,2011,33(7):1134-1138.
  [4] he haibo, xu jia, xu yuanqing, et al. cardioprotective effects of saponins from panax japonicus on acute myocardial ischemia against oxidative stress-triggered damage and cardiac cell death in rats[j]. journal of ethnopharmacology,2012,140:73-82.
  [5] 钱丽娜,陈平,李小莉,等.竹节参总皂苷成分的抗疲劳活性[j].中国医院药学杂志,2008,28(15):1238-1240.
  [6] 张海滨,张长城,何毓敏,等.竹节参总皂苷不同提取工艺的比较研究[j].现代生物医学进展,2013,13(18):3457-3460.
  [7] yadav u, ramana k, srivastava s. aldose reductase inhibition suppresses airway inflammation[j]. chemico-biological interactions, 2011,191(1):339-345.


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