类风湿关节炎患者雷公藤甲素血清浓度测定及其药动学研究

   阅文网   2020-07-28 00:00:00

  摘要:目的 建立滋阴明目片的质量标准。方法 采用薄层色谱法对滋阴明目片中的牡丹皮、山萸肉、羌活、石菖蒲进行定性鉴别,采用高效液相色谱法对丹参中的丹酚酸b进行含量测定。色谱柱为kromasil ods柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),以甲醇-乙腈-1.67%甲酸水(24∶10∶66)为流动相,检测波长为286 nm,流速为1.0 ml/min,柱温:30 ℃。结果 在薄层色谱中可检出牡丹皮、山萸肉、羌活、石菖蒲的特征斑点,且斑点清晰,易于观察。丹酚酸b的进样量在0.32~1.92 μg范围内线性关系良好,r=0.999 9(n=5),平均加样回收率为99.91%,rsd=0.63%(n=6)。结论 该法专属性强,重复性好,结果准确,可用于滋阴明目片的质量控制。
  关键词:滋阴明目片;质量标准;丹酚酸b;薄层色谱法;高效液相色谱法
  滋阴明目方是湖南中医药大学第一附属医院眼科协定处方制剂,由山萸肉、熟地黄、黄精、牡丹皮等药材组成,具有滋阴、活血、利水的功效,临床用于原发性视网膜色素变性等眼疾疗效显著[1-2]。滋阴明目片是由滋阴明目丸改剂型而成,为控制滋阴明目片的质量,确保其临床疗效,本研究采用薄层色谱法对方中牡丹皮、山萸肉、羌活、石菖蒲进行定性鉴别,高效液相色谱法对方中丹参的主要成分丹酚酸b进行含量测定。
  1 仪器与试药
  agilent 1100 series 高效液相色谱系统(安捷伦科技有限公司),kq-600型超声波清洗器(昆山市淀山湖检测仪器厂),ar2140电子天平(奥豪斯仪器上海有限公司)。
  牡丹皮对照药材(批号121521-200504)、山萸肉对照药材(批号121528-200408)、羌活对照药材(批号121362-200407)、石菖蒲对照药材(批号121536- 200502)、丹酚酸b对照品(批号must-12020104),均由中国药品生物制品检定所提供。滋阴明目方药材(湖南中医药大学第一附属医院采购,批号20120615,经刘绍贵教授鉴定均符合药典标准)。乙腈为色谱纯,水为重蒸水,其他试剂均为分析纯。
  2 方法与结果
  2.1 薄层色谱鉴别
  2.1.1 牡丹皮 取本品样品6.0 g,研细,加无水乙醇超声提取(功率250 w,频率40 khz)30 min,放冷,滤过,滤液挥干,加2 ml丙酮溶解作为供试品溶液。取不含牡丹皮的阴性样品6.0 g,同法制成阴性对照溶液。另取丹皮对照药材1.0 g,同法制成对照药材溶液。照2010年版《中华人民共和国药典》(一部)附录ⅵb薄层色谱法试验[3]160,吸取供试品溶液、阴性对照溶液和对照药材溶液各10 μl,点于同一块硅胶g薄层板上,以环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(20∶5∶0.5)为展开剂,展开,取出、晾干,喷以2%香草醛硫酸乙醇溶液(1→10),于105 ℃烘箱加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中,在与对照药材溶液相应位置上显相同颜色橘黄色荧光斑点,阴性对照溶液色谱则无此斑点。
  2.1.2 山萸肉 取本品样品3.0 g,研细,加乙酸乙酯20 ml,超声处理20 min,滤过,滤液挥干,残渣加2 ml无水乙醇溶解作为供试品溶液。取缺山萸肉的阴性样品3.0 g,同法制成阴性对照溶液。另取0.5 g山萸肉对照药材,同法制成对照药材溶液。照2010年版《中华人民共和国药典》(一部)附录ⅵb薄层色谱法试验[3]26,吸取供试品溶液、阴性对照溶液和对照药材溶液各10 μl,点于同一块硅胶g薄层板上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(20∶4∶0.5)为展开剂,展开、取出、晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,于105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中,在与对照药材溶液相应位置显相同颜色的斑点,阴性对照溶液色谱则无此斑点。
  2.1.3 羌活 取本品样品4.0 g,研细,加石油醚(60-90)30 ml回流提取30 min,滤过,滤液挥干,残渣加1 ml乙酸乙酯溶解作为供试品溶液。取缺羌活的阴性样品4.0 g,同法制成阴性对照溶液。另取0.5 g羌活对照药材,同法制成对照药材溶液。照2010年版《中华人民共和国药典》(一部)附录ⅵb薄层色谱法试验[3]170,吸取供试品溶液、阴性对照溶液和对照药材溶液各10 μl,点于同一块硅胶g薄层板上,以正己烷-苯-乙酸乙酯(16∶8∶8)为展开剂,展开、取出、晾干,喷以1%香草醛硫酸溶液,置365 nm紫外光灯下检视,供试品溶液色谱中,在与对照药材溶液相应位置上显相同颜色的荧光斑点,阴性对照溶液色谱则无此斑点。
  2.1.4 石菖蒲 取取本品样品4.0 g,研细,加石油醚(60-90)30 ml回流提取30 min,滤过,滤液蒸干,残渣加1 ml石油醚溶解作为供试品溶液。取缺石菖蒲的阴性样品,同法制成阴性对照溶液。另取0.5 g石菖蒲对照药材,同法制成对照药材溶液。照2010年版《中华人民共和国药典》(一部)附录ⅵb薄层色谱法试验[3]85,吸取供试品溶液、阴性对照溶液和对照药材溶液各5 μl,点于同一块硅胶g薄层板上,以石油醚(60-90)-乙酸乙酯(20∶5)为展开剂,展开、取出、晾干,放置1 h,置于365 nm紫外灯下检视。供试品溶液色谱中,在与对照药材溶液相应位置上显相同颜色的荧光斑点,阴性对照溶液色谱则无此斑点。
  2.2 含量测定
  2.2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱:kromasil ods柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:甲醇-乙腈-1.67%甲酸溶液(24∶10∶66);检测波长:286 nm;流速:1.0 ml/min;柱温:25 ℃;理论塔板数按丹酚酸b峰计算不低于2000。
  2.2.2 对照品溶液制备 称取经五氧化二磷干燥至恒重的丹酚酸b对照品适量,精密称定,置25 ml容量瓶中,加入80%甲醇溶解,定容,制得每1 ml含丹酚酸b 0.16 mg的对照品溶液。   2.2.3 供试品溶液制备 取滋阴明目片3片,研细,取0.5 g,精密称定,置10 ml容量瓶中,加80%甲醇10 ml,超声处理(功率250 w,频率40 khz)30 min,放冷后定容至刻度,滤过,续滤液作为供试品溶液。
  2.2.4 阴性对照溶液制备 取缺丹参的其余药味,按制备工艺要求制成不含丹参的阴性对照制剂,以供试品溶液制备的方法制备阴性对照溶液。
  2.2.5 阴性干扰试验 取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液,按上述色谱条件测定,结果在丹酚酸b色谱峰位置处无相应峰出现,表明方中其他药味对丹酚酸b的测定无干扰。色谱图见图2。
  2.2.6 线性关系考察 精密吸取"2.2.2"项下对照品溶液2、4、6、8、10、12 μl分别进样,测定峰面积。以峰面积值对进样量进行线性回归,得回归方程y=1035.6x-20.733,r=0.999 9(n=6)。丹酚酸b进样量在0.32~1.92 μg范围内线性关系良好。
  2.2.7 精密度试验 精密吸取供试品溶液在拟订的色谱条件下重复进样6次,结果峰面积的rsd=1.91%,表明仪器精密度良好。
  2.2.8 稳定性试验 取同一供试品溶液分别于配置后0、1、2、4、8 h进样,测定丹酚酸b的峰面积,结果峰面积的rsd=1.36%,表明供试品溶液在8 h内稳定性良好。
  2.2.9 重复性试验 取批号为20120816的样品,平行制备6份供试品溶液,并依法测定丹酚酸b的含量。结果丹酚酸b的平均含量为1.79 mg/g,rsd=1.24%,表明该方法重复性好。
  2.2.10 加样回收率试验 精密称取6份批号为20120816的样品,分别加入丹酚酸b对照品适量,按"2.2.3"项下方法制备并测定,结果见表1。
  3 讨论
  滋阴明目片中丹参活血袪瘀,协助君药补肾养阴、益肝明目,共奏滋补肝肾、活血化瘀之功。丹酚酸b为丹参中的有效成分之一,因此,笔者以丹酚酸b的含量作为滋阴明目片的质量控制指标,参考有关文献[4-6]建立了hplc测定本品中丹酚酸b含量的方法。
  2010年版《中华人民共和国药典》(一部)中测丹参中丹酚酸b含量的流动相为甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59),在此流动相比例下丹酚酸b出峰时间过早,与其他峰不能很好分离,故将比例调整为甲醇-乙腈-1.67%甲酸溶液(24∶10∶66);而且在试验中,比较了分别用60%、70%、80%的甲醇超声提取30 min或者加热回流1 h的样品处理方法,结果发现,加热回流1 h制备的供试品溶液中的丹酚酸b含量稍高于用超声提取30 min制备的供试品溶液,但差别不大,其中用80%的甲醇提取的浓度最高,考虑到超声提取方法简便、节能,故确定用80%的甲醇超声提取30 min。上述方法能将样品中的杂质与丹酚酸b分离开,且稳定可靠、准确,重复性好,可用于滋阴明目片的质量控制。
  滋阴明目片中的山萸肉、羌活、石菖蒲药材均采用2010年版《中华人民共和国药典》的薄层色谱法鉴别,结果表明山萸肉、羌活、石菖蒲的阴性无干扰。牡丹皮的薄层鉴别则先采用药典方法,药材无斑点,后将制备过程中的乙醚提取换成乙醇提取,则能得到明显橘黄色斑点,阴性无干扰。以上4味药材的鉴别可作为滋阴明目片的质量标准。
  参考文献:
  [1] 艾明,孙明,李岱.视网膜色素变性的治疗进展[j].国际眼科杂志, 2010,10(7):1324-1326.
  [2] 何文安,张虎,代丽华,等.视网膜色素变性的研究进展[j].基层医学论坛,2008,12(35):1132-1133.
  [3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[s].北京:中国医药科技出版社,2010.
  [4] 蒋桂香,吕应年,范世锦,等.浓缩丹参骨宝颗粒中水溶性有效成分的质量控制研究[j].中国医药导报,2011,8(34):67-69.
  [5] 吕鹏,张振凌,杨锁成.hplc测定复方丹参降浊丸中丹酚酸b的含量[j].中国中医药现代远程教育,2011,9(21):134-135.
  [6] 刘亚英,梁敏,杜艳玲,等.hplc法同时测定注射用冠心宁中原儿茶醛、阿魏酸、丹酚酸b的含量[j].中国药师,2011,14(10):1469-1471.


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