寿胎丸对复发性流产小鼠蜕膜组织α—烯醇化酶表达的影响

   阅文网   2020-07-28 00:00:00

  摘要:目的 通过观察寿胎丸对复发性流产小鼠蜕膜组织α-烯醇化酶表达的影响,探讨其安胎的作用机制。方法 cba/j×balb/c建立正常妊娠模型,cba/j×dba/2建立复发性流产模型,将复发性流产模型cba/j×dba/2孕鼠按怀孕先后顺序随机分为模型组及寿胎丸高、中、低剂量组,从妊娠第1日开始灌胃给药,至孕14 d处死小鼠,采用免疫组化与蛋白印迹方法检测各组蜕膜组织α-烯醇化酶的表达。结果 小鼠模型组与正常组比较,α-烯醇化酶表达明显升高,差异有统计学意义(p<0.01);与模型组比较,寿胎丸高、中、低剂量组α-烯醇化酶表达均降低,差异有统计学意义(p<0.01);寿胎丸高剂量组α-烯醇化酶表达与中、低剂量组之间差异无统计学意义(p>0.05)。结论 寿胎丸通过下调复发性流产小鼠蜕膜组织α-烯醇化酶的表达,从而实现维持妊娠,这可能是其安胎的作用机制之一。
  关键词:寿胎丸;复发性流产;蜕膜组织;α-烯醇化酶;小鼠
  自然流产系指妊娠不足28周、胎儿体质量不足1000 g而终止者,当自然流产连续发生2次及以上时则称之为复发性流产。复发性流产属中医学"滑胎"范畴,多为先天不足,复损肾气,以致不能荫胎系胎。寿胎丸源自张锡纯的《医学衷中参西录》,临床上用于治疗滑胎[1-3]。本课题前期进行了蛋白质组学研究,相关实验观察到复发性流产小鼠蜕膜组织中α-烯醇化酶表达升高,与模型组比较,寿胎丸各组该蛋白质点表达明显降低[4]。为了进一步验证其结果,本实验拟采用免疫组化与蛋白印迹方法检测寿胎丸对复发性流产小鼠蜕膜组织α-烯醇化酶表达的影响,探讨寿胎丸安胎的分子机制。
  1 实验材料
  1.1 动物
  健康雌性cba/j小鼠50只,spf级,8周龄,中国医学科学院实验动物研究所提供,许可证号:scxk(京)2009-0004;健康雄性dba/2小鼠20只,spf级,8周龄,上海斯莱克实验动物有限责任公司提供,许可证号:scxk(沪)2007-0005;健康雄性balb/c小鼠5只,spf级,8周龄,湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供,许可证号:scxk(湘)2009-0004。
  1.2 药物
  寿胎丸由菟丝子、桑寄生、续断、阿胶组成,湖南中医药大学附属第一医院药剂科按照《医学衷中参西录》[5]寿胎丸处方用量比例配伍,采用水提醇沉法制备浓缩液(含原药材1 g/ml)。
  1.3 主要仪器与试剂
  bmj-1生物组织包埋机(天津航空机电公司), shandon325石蜡切片机(英国shandon公司),leica dm lb2双目显微镜(德国leica公司),motic b5显微摄像系统(麦克奥迪实业集团公司),mias医学图像分析系统(北航公司);低温高速离心机(德国eppendorf公司),紫外分光光度计(美国beckmen公司),垂直电泳槽、转移电泳槽及电泳仪(美国bio-rad公司),图像扫描仪(美国bio-rad公司),kodak digital science id图像分析系统(美国kodak公司)。免疫组化hsp27一抗、sabc试剂盒及dab显色试剂盒(美国proteintech公司);蛋白印迹hsp27一抗、β-actin一抗、辣根过氧化物酶(hrp)标记的二抗试剂盒及ecl发光试剂盒(美国bethyl公司)。
  2 实验方法
  2.1 造模
  将50只雌性cba/j小鼠分别与20只雄性dba/2和5只雄性balb/c小鼠按2∶1合笼交配,检到阴栓者计为妊娠第0日,分别建立复发性流产模型40只与正常妊娠模型10只。
  2.2 分组与给药
  10只cba/j×balb/c孕鼠作为正常妊娠组,40只cba/j×dba/2孕鼠作为复发性流产模型。按妊娠顺序随机分为模型组及寿胎丸低[3 g/(kg·d)]、中[6 g/(kg·d)]、高[12 g/(kg·d)]剂量组,每组10只。自妊娠第1日开始,正常妊娠组和模型组给予等量的生理盐水灌胃,寿胎丸各组给予不同剂量的寿胎丸混悬液灌胃,直至孕14 d。
  2.3 标本制备
  断颈处死孕14 d小鼠,妊娠子宫离体后,自子宫角处钝性撕开子宫壁,将胎儿胎盘单位从着床部位剥离,用小号组织剪刀分离着床部位的蜕膜组织,取5个着床部位,用预冷的pbs冲洗干净后,迅速置于液氮中保存。切取1 cm大小的子宫组织(含蜕膜组织),修整后用pbs冲洗,迅速放入4%多聚甲醛固定液(含有1‰depc)固定12 h,将固定好的蜕膜组织取出,室温下经梯度酒精脱水(70%a→80%a→95%aⅰ→95%aⅱ→100%aⅰ→100%aⅱ),二甲苯透明,浸蜡,石蜡包埋,备用。
  2.4 免疫组化检测
  石蜡切片厚度5 m,常规脱蜡至水,3%h2o2 10 min,抗原修复10 min,一抗4 ℃过夜,二抗37 ℃ 30 min,dab显色,苏木素复染,常规脱水、二甲苯透明、树脂胶封固,显微镜观察。采用图像分析系统,每组选取6张切片,每张切片随机观察5个视野,精确选取视野内所有阳性颗粒,计算机自动算出面密度(阳性目标总面积/统计场总面积),用于定量表达免疫组化阳性反应程度。
  2.5 蛋白印迹检测
  将蜕膜组织从液氮中取出,加入适量蛋白裂解液(按50 mg标本用1 ml裂解缓冲液),冰浴裂解l h,4 ℃、12 000 r/min离心45 min,取上清即为蜕膜组织总蛋白。蛋白质浓度测定采用amersham biosciences公司专门针对蛋白质组学研究的蛋白质抽提设计的2d quant kit定量试剂盒。50 μg总蛋白上样进行sds-page电泳,分离后的蛋白10 v恒压25 min转移至硝酸纤维素膜。5%脱脂奶粉室温封闭2 h,加入1∶200稀释的α-烯醇化酶一抗4 ℃孵育过夜,再置于1∶1000稀释的hrp标记的二抗稀释液中室温孵育2 h,洗膜后加入ecl发光液显色曝光。同时以β-actin作为上样量的内参照,将所得x光片扫描,记录的照片通过计算机图像分析系统,计算各组指标与β-actin的光密度比值,作为α-烯醇化酶的相对表达量。   3 统计学方法
  采用spss18.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示,多个样本均数比较采用方差分析,组间方差分析用f检验,有差异的组间两两比较用snk-q检验。p<0.05表示差异有统计学意义。
  4 结果
  4.1 免疫组化检测结果
  采用图像分析系统计算面密度并进行统计分析。结果显示,α-烯醇化酶主要表达在细胞浆及细胞核上,免疫组化染色呈棕黄色,模型组与正常组比较,α-烯醇化酶表达明显增多,差异有统计学意义(p<0.01);寿胎丸高、中、低剂量组与模型组比较,α-烯醇化酶表达均减少,差异有统计学意义(p<0.01);寿胎丸各剂量组α-烯醇化酶表达差异无统计学意义(p>0.05)。见表1、图1。
  4.2 蛋白印迹检测结果
  以β-actin作为内参,计算α-烯醇化酶/β-actin比值并进行统计分析。结果显示,模型组与正常组比较,蜕膜α-烯醇化酶表达明显升高,差异有统计学意义(p<0.01);与模型组比较,寿胎丸高、中、低剂量组蜕膜α-烯醇化酶表达均降低,差异有统计学意义(p<0.01);寿胎丸高剂量组蜕膜α-烯醇化酶表达与中、低剂量组之间差异无统计学意义(p>0.05)。见表2、图2。
  5 讨论
  烯醇化酶是1934年lohman和mayerhof在研究肌肉提取物中磷酸甘油酸向丙酮酸转换的过程中发现的。它既可催化糖酵解过程中2-磷酸-d-甘油酸(pga)向磷酸-烯醇式丙酮酸(pep)的转化,又可在糖原合成过程中,催化逆向反应,即作为磷酸丙酮酸水合酶,使pep向pga转化,因此烯醇化酶在细胞能量代谢过程中起重要的作用。在脊椎动物中,烯醇化酶存在α、β、γ三种同工酶,其中α-烯醇化酶在许多组织均存在,β-烯醇化酶几乎仅见于肌肉组织,γ-烯醇化酶则主要存在于神经元和神经内分泌组织[6]。
  作为糖酵解过程中的关键酶,α-烯醇化酶在生物界中普遍存在。细胞的生命活动时刻需要能量的供给,α-烯醇化酶正是通过调节细胞的产能过程,维持细胞atp水平,保证细胞的存活及其生理功能的执行[7]。在肌肉和脑这2个对能量需求高的组织中表现尤为突出。当这2种组织处在不同病理生理状态时, α-烯醇化酶作为一种能量代谢过程中重要的酶,其表达水平和活性也发生适应性变化,以满足细胞不同状态下的需求。已知在心脏发育过程中,随着从在子宫中相对低氧环境到出生后的常氧状态以及从胚胎向成熟心肌的转变,细胞对氧气的利用和底物的选择发生了巨大变化,从胚胎时期以糖原乳酸的氧化、糖酵解产能转变为成年后以脂肪酸有氧氧化为主,所以糖酵解酶α-烯醇化酶水平也相应降低。当心肌能量需求增加或供能相对不足时,作为一种代偿,心肌通过提高糖的利用率及增加糖酵解以维持供能,此时α-烯醇化酶等糖酵解酶表达增加。这一点在主动脉缩窄所致心肌肥大模型及缺氧再灌注损伤的心肌组织中均得到证实。一项比较蛋白质组学的研究也发现,自发性高血压大鼠肥厚的左室心肌中α-烯醇化酶蛋白表达明显增加,提示该蛋白可能参与了高血压左室肥厚的病理过程[8]。在糖尿病心肌病及左室功能失调时也观察到类似现象。目前认为,增龄相关的脑功能失调时氧化应激扮演了重要角色,老化的细胞中过氧化的不饱和脂肪酸堆积、单位耗氧增加、抗氧化防御能力削弱。poon等[9]通过观察小鼠的脑组织发现,随着年龄增加,enol、dynamin-1和乳酸脱氢酶等蛋白表达明显增加,其中糖酵解酶的持续增加可能抑制脂肪酸的氧化,损害脑细胞能量代谢,影响细胞功能,故推测这些蛋白与老年脑功能失常有关。研究表明,当细胞低氧时,呼吸链中相关酶基因的表达降低,而编码糖酵解酶(如α-烯醇化酶)的相关基因表达将被增强[10]。
  本实验分别采用免疫组化与蛋白印迹方法检测模型组、正常组及寿胎丸高、中、低剂量组小鼠蜕膜组织α-烯醇化酶,结果显示,模型组与正常组相比较,α-烯醇化酶表达明显升高,差异有统计学意义(p<0.01),提示自然流产子宫蜕膜组织细胞可能处于低氧状态,造成蜕膜血供不足,进而影响胚胎早期发育而使胚胎流产风险增高。寿胎丸高、中、低剂量组与模型组比较,蜕膜α-烯醇化酶表达均降低,差异有统计学意义(p<0.01)。由此提示,寿胎丸能有效改善蜕膜组织缺氧状态,使细胞内atp的产生途径从糖酵解回归到氧化磷酸化。下调复发性流产小鼠蜕膜组织α-烯醇化酶的表达可能是其安胎的作用机制之一。
  参考文献:
  [1] 苗凌娜.寿胎丸加味治疗习惯性流产35例[j].四川中医,2011,29(7):93-94.
  [2] 丘春东,孔晓玲.寿胎丸治疗免疫因素所致复发性流产68例的临床观察[j].中国医药指南,2011,9(19):309.
  [3] 谢玲,王玉.寿胎丸加味治疗先兆流产和习惯性流产43例[j].江西中医药,2011,42(6):51.
  [4] 谭展望,雷磊.蛋白质组学与滑胎证治研究思路和方法初探[j].中华中医药杂志,2012,27(11):2880-2883.
  [5] 张锡纯.医学衷中参西录[m].石家庄:河北人民出版社,1974:258.
  [6] 朱理安,方宁远.α-烯醇化酶——古老的蛋白,崭新的功能[j].国际病理科学与临床杂志,2007,27(4):347-350.
  [7] 朱理安,方宁远,高平进,等.α-烯醇化酶靶向rna干扰对原代培养乳鼠心肌细胞能量代谢及收缩功能的影响[j].中华高血压杂志,2008, 16(1):41-45.
  [8] xian j, li x, li-shun w, et a1. differential protein expression in hypertrophio haart with and without hypertention in spontaneously hypertansive rats[j]. proteomicx,2006,6(3):1948- 1956.
  [9] poon hf, vaishnav ra, getchell tv,et al. quantitative proteomics analysis of differental protein expression and oxidative modification of specific proteins in the brains of old mice[j]. neurobiol aging,2006,27(7):1010-1019.
  [10] 张磊,门可,张景霞,等.人正常早孕滋养细胞体外培养株的系统鉴定[j].中国公共卫生,2006,22(7):818-820.


寿胎丸对于复发流产小鼠组织醇化表达影响



  • 微信
  • QQ好友
  • QQ空间
  • 新浪微博

系统推荐

类风湿关节炎患者雷公藤甲素血清浓度测定及其药动学研究

摘要:目的 建立滋阴明目片的质量标准。方法 采用薄层色谱法对滋阴明目片中的牡丹皮、山萸肉、羌活、石 ...

HPLC测定增液承气口服液中梓醇含量

摘要:目的 建立增液承气口服液中梓醇的含量测定方法。方法 采用高效液相色谱法,色谱柱为eclips ...

加速溶剂萃取法测定大枣中有机氯及拟除虫菊酯类农药残留量

摘要:目的 建立快速同时测定大枣中50种有机氯及拟除虫菊酯农药残留的气相色谱测定方法。方法 样品用 ...

HPLC测定肝泰舒胶囊中獐牙菜苦苷含量

摘要:目的 建立高效液相色谱方法测定肝泰舒胶囊中獐牙菜苦苷含量的方法。方法 采用waters sy ...

五子补肾胶囊成型工艺研究

摘要:目的 探讨五子补肾胶囊的成型工艺。方法 以吸湿率为指标考察辅料的种类和配比,并考察颗粒的休止 ...

不同纯度高良姜素对A375—HaCaT共培养模型中黑素细胞增殖及黑素合成的影响

摘要:目的 研究不同纯度高良姜素对人黑色素瘤细胞-人永生化角质形成细胞(a375-hacat)共培 ...

不同工艺提取的竹节参皂苷粗提物毒性及其抗炎作用初步研究

摘要:目的 比较不同工艺提取的竹节参皂苷粗提物的毒性及抗炎效果。方法 采用不同工艺分别制备竹节参皂 ...

湖南省中医药在医药卫生体制改革中的作用分析

摘要:目的 通过中医药发展对基层卫生机构业务量、居民医疗服务需求、医疗服务费用水平的影响分析,明确 ...

黄芪甲苷对心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡的影响

摘要:目的 观察黄芪甲苷对大鼠心肌细胞线粒体的保护作用及其抗心肌细胞凋亡的作用,探讨其治疗心力衰竭 ...

芦荟全叶冻干粉的一般药理学实验研究

摘要:目的 观察芦荟全叶冻干粉对实验动物心血管系统、中枢神经系统和呼吸系统的影响,探讨其一般药理作 ...

脑卒中高危人群中医症状及舌脉特点分析

摘要:目的 初步探讨脑卒中高危人群的中医症状及舌脉特点,为脑卒中的中医预防提供辨证论治依据,并为脑 ...

浅议数学教学中学困生的转化问题

初中数学学困生的形成主要表现在以下几个方面:对数学基本概念、公式、定理模糊,不能准确地用数学语言进 ...

浅谈高中历史教学中的情感教育与学习动机教育

高中历史教学中的情感教育与学习动机教育,是一项长期的教育任务。实践证明,只有认真加强教学中的情感教 ...

浅谈影响中学生成才观形成的因素及对策

我国社会经历了伟大的变革,已进入一个崭新的时代。树立什么样的成才观,既关系到这个伟大时代的盛衰 , ...

初中化学教学成绩的提高刍议

在教学实践过程中,如何将教师的主导作用与学生的主体性有机结合起来,从而进一步提高教学质量,发展学生 ...

政治教学中如何培养学生的自我认识能力之我见

自我认识能力的培养是实施素质教育的一个重要课题。它主要是以发掘人的自我认识能力,弘扬人的主体精神, ...

提高生物课堂教学效果的有效途径

生物教学要把素质教育落到实处,我们教师就得改进教学方法,培养创新的能力。新课程标准既要求教师的观念 ...

提高农村中学语文教学质量之我见

教育教学改革已深入到全面推进新课程阶段,新的理念正广泛的被教师运用到教育教学之中,因学校管理的需要 ...

浅谈新课程下的小学数学教学

新课程改革倡导有效教学,所谓教学有效性指在教学活动中,教师采用各种方式和手段,用最少的时间、最小的 ...

初中语文诵读教学之我见

诵读是我国传统语文和当代阅读教学的重要方法。语文教学新大纲也明确指出:"诵读是阅读教学中最经常最重 ...


版权所有:阅文网 www.13meiwen.com

免责声明:本网站信息来源于网络,免费共享,仅供学习和研究使用,版权和著作权归原作者所有,如有侵权,请通知我们删除信息。

      浙ICP备19022628号-16

返回顶部